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Western Blot 实验原理及相关试剂详解

Western Blot 实验原理:蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,也称Western、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

与 Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝 酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与?#26434;?#30340;抗 体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自?#26434;?#20197;检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。

Western Blot 实验步骤:样?#20998;?#22791;、上样与电泳、转膜、封闭、抗体孵育和检测


Western Blot 实验试剂:

   样?#20998;?#22791;   


   蛋白定量   

应用: WB;Dot;ELISA 推荐稀释浓度: 1:500-1:5000
同?#20013;停?#23567;鼠lgG 特异性:适用所有物种
Bradford 法是最简单和快速的比色蛋白定量方法,Bradford 方法进行了改?#36857;?#26368;大限度的加大蛋白定量的线性范围,变异性小于普通考马斯亮?#24230;?#33394;法,灵敏度范围为 100~1500 μg/mL。
BCA蛋白定量试剂盒,45分钟内可完成测定,蛋白质测定范围是20~2000 μg/mL。

注:用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品,可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度;由于含有?#32454;?#27987;度的去垢剂,不能用Bradford法测定由RIPA裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。


   孵育盒    


   凝胶溶液   


   电泳及上样缓冲液    


   蛋白Marker   


   染色液    


   转膜缓冲液   


   转印膜   



   酶标二抗    

二抗建议稀释范围:
免疫组化/免疫化学:1:500 - 1:5,000
ELISA 和 WB(显色底物):1:5,000 - 1:100,000
WB(ECL化学发光底物):1:10,000 - 1:200,000
防腐剂:无添加 (叠氮化钠作为防腐剂的使用将大大?#31181;评备?#36807;氧化物酶的酶活性)。


   封闭    


   内参及标签抗体    

应用: WB;Dot;ELISA 推荐稀释浓度: 1:500-1:5000
同?#20013;停?#23567;鼠lgG 特异性:适用所有物种


   显色试剂    

拜尔迪超敏化学发光液是一种基于鲁米诺的超灵敏、极低背景的化学发光检测底物溶液。通过加入促进化学发光信号的复?#26174;?#24378;剂,对蛋白印迹实验中?#22791;?#36807;氧化物酶的检测具有极高灵敏度,可以检测到≤0.05ng/ml 浓度的 HRP。

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